Zellfreien Proteinsynthese und Einzelmolekülstudien

  Zellfreie Proteinsynthese Urheberrecht: Fitter  

Illustration der wechselseitigen Vorteile bei der Kombination von zellfreier Proteinsynthese und der Anwendung von Einzelmolekültechniken.

 

Die Proteinsynthese ist ein essentieller zellulärer Prozess, bei dem Ribosomen die genetische Information in eine Sequenz von Aminosäuren übersetzt. Dieser hochkomplexe Vorgang wird von einer „Translationsmaschinerie“ bewerkstelligt, welche Ribosomen, unterstützende Proteine, tRNA, mRNA und verschiedene Faktoren beinhaltet. Die Tatsache, dass die Proteinsynthese nicht notwendigerweise in einer lebenden Zelle ablaufen muss, sondern auch in zellfreien Proteinsynthese-Assays stattfinden kann, hat in der Praxis aufschlussreiche Studien zur Synthese ermöglicht. Wir haben im Rahmen unserer Forschung von diesem Potential Gebrauch gemacht, indem wir die Synthese des „green fluorescence protein“ (GFP) in Echtzeit auf Einzelmolekülniveaus verfolgt haben. Die Unterdrückung der Proteinloslösung vom Ribosom nach der Proteinsynthese und die zeitaufgelöste Fluoreszenzdetektion ermöglichten es uns, die GFP Entstehungszeiten und die Quantifizierung des Anteils aktiver Ribosomen in dem Reaktions-Assay zu bestimmen. Darüber hinaus kann auch die Gesamtsyntheseaktivität bei veränderten Bedingungen (z.B. mit und ohne crowding) im in-vitro Assay bestimmt werden. In einem weiteren Ansatz haben wir mit Hilfe spezieller in-vitro Assays unnatürliche bzw. modifizierte Aminosäuren in die synthetisierte Polypeptidkette eingebaut. Damit stehen leistungsfähige Methoden zu ortspezifischen Farbstoffmarkierung von Proteinen zur Verfügung, welche das Anwendungsgebiet der Einzelmolekül FRET-Studien deutlich erweitern können (z.B. Studium „Cystein“ reicher Proteine, ko-translationale Proteinfaltung)

 

Publikationen

Katranidis A and Fitter J
Single-Molecule Techniques and Cell-Free Protein Synthesis: A Perfect Marriage
Anal. Chem., 91 (4), 2570–2576 (2019)

M. Sadoine, M. Cerminara, M. Gerrits, J. Fitter and A. Katranidis
Cotranslational Incorporation into Proteins of a Fluorophore Suitable for smFRET Studies.
ACS Synth Biol., 7, 405-411, (2018)

M. Sadoine, M. Cerminara, N. Kempf , M. Gerrits, J. Fitter and A. Katranidis
Selective Double-Labeling of Cell-Free Synthesized Proteins for More Accurate smFRET Studies
Anal. Chem., 89, 11278-11285, (2017)

N. Kempf , C. Remes, R. Ledesch, T. Züchner, H. Höfig, I. Ritter, A. Katranidis and J. Fitter
A Novel Method to Evaluate Ribosomal Performance in Cell-Free Protein Synthesis Systems
Scientific Reports, 7: 46753, (2017)

P. Lamprou, D. Kempe, A. Katranidis, G. Büldt, and J. Fitter
Nanosecond Dynamics of Calmodulin and Ribosome-Bound Nascent Chains Studied by Time-Resolved Fluorescence Anisotropy .
ChemBioChem, 15, 977-985, (2014)

A. Katranidis, D. Atta, R. Schlesinger, K.H. Nierhaus, T. Choli-Papadopoulou, I. Gregor, M. Gerrits, G. Büldt and J. Fitter
Fast biosynthesis of GFP molecules - a single molecule fluorescence study
Angewandte Chemie Int. Edit., 48, 1758-1761, (2009)